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支原體PCR絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品的說(shuō)明及復(fù)溶操作

更新時(shí)間:2022-10-19  |  點(diǎn)擊率:514
  支原體PCR絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)支原體PCR或qPCR方法進(jìn)行驗(yàn)證,除了可參考試劑盒生產(chǎn)廠家自身的驗(yàn)證外(盡管它不能*替代用戶自己的驗(yàn)證,但可提供特異性驗(yàn)證的一些信息,如使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞DNA、某些細(xì)菌菌屬DNA等,而不必使用者自己再去嘗試),用戶自己主要是對(duì)方法的檢測(cè)限和耐用性進(jìn)行驗(yàn)證,這里常用的就是10CFU支原體標(biāo)準(zhǔn)品。100CFU標(biāo)準(zhǔn)品可作為一個(gè)補(bǔ)充。
  支原體PCR絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品的說(shuō)明:
  1.定量標(biāo)準(zhǔn)品dna包括支原體基因組dna和細(xì)菌基因組dna,用于梯度稀釋后,qpcr標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。
  2.支原體基因組dna用于支原體核酸擴(kuò)增檢測(cè)的方法學(xué)驗(yàn)證,包括確定支原體qpcr方法的檢測(cè)限。
  3.細(xì)菌定量標(biāo)準(zhǔn)品dna用于qpcr檢測(cè)水中細(xì)菌的精確定量。
  復(fù)溶操作:
  1.標(biāo)準(zhǔn)品短時(shí)離心,以收集凍干粉至管底。
  2.取試劑盒提供的tris緩沖液(白蓋)100µl,加入到標(biāo)準(zhǔn)品管內(nèi)(綠蓋)。
  3.室溫下靜置5分鐘。
  4.渦旋混合10秒鐘,離心5秒鐘。
  5.選合適體積的復(fù)溶dna用于pcr擴(kuò)增或梯度稀釋,以制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。
  支原體PCR絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品每批支原體都會(huì)提供CFU與基因拷貝數(shù)的比值,以方便二者的換算。因?yàn)?0CFU只能確定PCR能夠達(dá)到的檢測(cè)限在10CFU以下,但無(wú)法具體確定靈敏度的數(shù)值。帶DNA拷貝數(shù)標(biāo)定的基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品則可進(jìn)一步確定檢測(cè)限的數(shù)值。而且核酸法最終檢測(cè)的對(duì)象是核酸,而產(chǎn)品的QC主要關(guān)注的是支原體,核酸的存在是側(cè)面反映支原體存在的一個(gè)指標(biāo)。CFU與基因拷貝數(shù)的比值很好地對(duì)二者進(jìn)行了關(guān)聯(lián)。
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