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如何判斷知道細胞被支原體污染了?

更新時間:2022-07-15  |  點擊率:627

發(fā)生污染,既耽誤時間又是一個災難,熟練的無菌操作能避免許多問題,但早期檢測污染是一種可以預警的方法。對于培養(yǎng)箱中的每瓶細胞都要注意觀察,要養(yǎng)成習慣,每次打開培養(yǎng)箱時,迅速看看有沒有發(fā)生污染。

細菌、酵母、真菌、霉菌、支原體以及其他的培養(yǎng)細胞都可能引起污染。

怎樣識別污染

一、肉眼觀察,把培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿拿起來,對著光線檢查。

  • 渾濁情況。即使細胞密度很高,培養(yǎng)基也應該是透明的。輕輕移動或晃動培養(yǎng)瓶,觀察培養(yǎng)基的渾濁或懸浮情況,一些霉菌可能會在培養(yǎng)基的表面形成菌落。

  • 培養(yǎng)基顏色的變化。酸性條件下,加了酚紅的培養(yǎng)基會由紅變黃,而堿性條件下會變成紅紫色。細菌污染常常會使培養(yǎng)基變成黃色,真菌污染會使培養(yǎng)基變成深紫紅色。

  • 聞!當然不能打開瓶子去聞,把鼻子貼在瓶口聞,許多污染發(fā)生以后都會散發(fā)出易察覺的、特殊的氣味,甚至一打開培養(yǎng)箱門就聞到了。

二、顯微觀察。在倒置顯微鏡下,先用低倍(10 X) 再用高倍(40 X) 物鏡(總放大倍數為400) 觀察細胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中的細胞:

  • 其他有機體。在低倍鏡下,真菌的菌絲體成長棒狀,并橫穿整個視野,還可以觀察到酵母,有時呈小圓球形,有時還有芽。

在高倍鏡下可以觀察到細菌,它們可能是棒狀或球狀,單獨成鏈或成團存在,它們也可能和細胞混在一起,并且明顯處于細胞內部,有些細胞可能已經裂解變得模糊。觀察時可能每兩個視野才出現一個污染(當然也算被污染了?。?,而且可能污染物是可以運動的。

  • 損傷細胞。感染會殺死細胞,可能導致每個細胞都裂解和/或細胞層從附著物上*剝離,更可能的是細胞變得不規(guī)則(或大或?。诘捅剁R下是黑色的粒狀

懸浮培養(yǎng)細胞比貼壁培養(yǎng)細胞更加難以顯微觀察,尤其是高倍顯微鏡下。

  • 將培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿放在顯微鏡的載物臺上,靜置一會。

  • 將焦距對準器皿的底部,觀察那些輕微附著的細胞,因為它們可能已經接觸到了微生物。

  • 對準整個培養(yǎng)瓶焦距,當發(fā)現細胞的時候,用細聚焦調節(jié)旋鈕調節(jié),仔細檢查周圍的培養(yǎng)基有沒有污染發(fā)生。

如果你不能確定是否發(fā)生了污染

  • 制作濕涂片或染色片。取1 ml 培養(yǎng)基離心,用50 μl 培養(yǎng)基或緩沖液重新懸浮細胞,滴一滴到載玻片,蓋上蓋玻片制成濕涂片;或涂片、固定并染色(甲基蘭或革蘭氏染液),在高倍鏡下觀察。

  • 將細胞在營養(yǎng)培養(yǎng)基或瓊脂培養(yǎng)基上劃線, 37℃培養(yǎng)3 天。如果有菌落,那么細胞被污染了。

  • 取1 ml 的細胞培養(yǎng)液至無菌的微量離心管中, 37℃培養(yǎng)3 天。觀察到渾濁物,做濕涂片顯微鏡觀察。

 

Mynox®殺除支原體功能強大有效,但價格較貴。

方法三:對于已耗費很多時間,大量擴增起來的細胞,或經過基因轉染、體外刺激等大量工作處理過的細胞,如果發(fā)現細胞被支原體污染了,怎么辦?此時由于前期工作量巨大,使操作人員無法丟棄已有細胞。

但由于價格原因,又無法使用方法二提到的昂貴試劑殺除細胞上的支原體,

同時,實驗人員還需要清除細胞上的支原體污染,讓實驗得以往下推進,以最終獲得準確的實驗數據。

此時,實驗者可選用對支原體有效的抑制劑,通過對細胞的前期處理,中期加藥,逐步通過4代左右的培養(yǎng),得以將支原體污染*清除,確保試驗順利推進,結果準確。

此類試劑眾多,筆者周圍的實驗人做過很多嘗試,其中效果最確切且性價比較高的當屬德國Minerva公司的ZellShield®祛除劑。

它的原理是:通過抑制支原體增殖中DNA和蛋白的合成,達到抑制新的支原體增殖的目的。屬復合型的新型抗生素。

注:使用ZellShield®時,不需使用鏈青霉素。

 

操作步驟:

第一步:研究發(fā)現,98%的支原體污染發(fā)生在細胞間隙。因此,首先要把細胞消化下來,放入離心管,懸浮沖洗,離心,棄上清,反復三次。此時可將細胞上大部分的支原體去除,為進一步加藥抑制做好準備。

第二步:培養(yǎng)液中加入1%的ZellShield®,細胞進行正常培養(yǎng)。新的支原體增殖受到抑制,舊的支原體隨著細胞的換液逐步減少,通過4代左右的培養(yǎng),細胞中的支原體基本可被*清除。

 

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