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您想了解細胞培養(yǎng)攻略嗎?

更新時間:2022-05-06  |  點擊率:709

什么是細胞傳代?

細胞傳代培養(yǎng)(subculture),當原代培養(yǎng)成功以后,隨著培養(yǎng)時間的延長和細胞不斷分裂,一則細胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制,生長速度減慢甚至停止;另一方面也會因營養(yǎng)物不足和代謝物積累而不利于生長或發(fā)生中毒。

將培養(yǎng)物分割成小的部分,重新接種到另外的培養(yǎng)器皿(瓶)內(nèi),再進行培養(yǎng)的過程被稱之為細胞傳代培養(yǎng)。對單層培養(yǎng)而言,80%匯合或剛匯合的細胞是較理想的傳代階段。

耗材準備

在實驗開始前,需要把實驗用品準備齊全。

酒精、預熱好的*培養(yǎng)基、PBS緩沖液、胰酶、培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿、移液器、移液管、離心管等

實驗用的超凈工作臺需提前半小時照射紫外線。


實驗操作

以貼壁細胞培養(yǎng)為例

1、穿好細胞房專用的實驗服,戴好滅菌手套和口罩。

2、從培養(yǎng)箱中取出細胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿(Tip1:一般選擇處于對數(shù)期的細胞),用75%酒精消毒外包裝后轉(zhuǎn)移至到超凈臺中。

3、打開蓋子(Tip2:如果是培養(yǎng)皿,只需打開一個縫隙即可,避免污染),輕輕吸出舊的培養(yǎng)液,加入適量PBS緩沖液洗滌1-2次(Tip3:注意從未培養(yǎng)細胞的側(cè)壁加入,以免沖掉細胞),棄去PBS緩沖液。

4、用移液器加入適量胰酶(Tip4:具體量根據(jù)實驗需要確定,提前將胰酶37℃預熱,效果更好),蓋好蓋子,“十字"晃動,使胰酶充分接觸細胞。

5、將加入胰酶的細胞培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到倒置顯微鏡載物臺,鏡下觀察細胞消化情況,當細胞變圓且大量脫落時,準備終止消化(Tip5:若初始的細胞密度比較高,加入胰酶后,肉眼也可觀察到細胞脫落,當細胞有一半左右脫落時,即可終止消化,避免反復將培養(yǎng)皿拿出超凈臺,避免增加污染的風險),用75%的酒精噴灑培養(yǎng)瓶表面,轉(zhuǎn)移到超凈臺。

6、用移液器加入等量含血清培養(yǎng)基,終止消化。移液器充分且柔和地吹打,避免產(chǎn)生氣泡,使細胞*脫落。

7、將培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中混合液體轉(zhuǎn)移至離心管中(離心管規(guī)格根據(jù)實驗需要確定),配平后離心3-5分鐘左右(離心機轉(zhuǎn)速根據(jù)細胞種類而定,常見的有1000-3000rpm/min)。

8、離心好后,用酒精噴壺噴灑離心管表面,轉(zhuǎn)移進超凈臺,打開蓋子,將上清液倒入廢液缸。

9、加入適量體積含血清培養(yǎng)基,用移液器或巴氏吸管輕輕吹打,制成細胞懸液。

10、將細胞懸液分裝進2個(或多個)潔凈滅菌培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中,加入適量培養(yǎng)基,蓋好蓋子。

11、將分裝好的培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡載物臺,觀察細胞情況,細胞應保證一定數(shù)量,數(shù)量太少會影響生長情況。

12、在培養(yǎng)瓶上做標記,注明傳代時間,細胞種類,操作人員等信息。在放入培養(yǎng)箱之前應再次用酒精噴一噴培養(yǎng)瓶表面,然后應記得整理操作臺,用75%酒精擦拭超凈臺臺面,清理廢液和垃圾。


科研實驗中,細胞的體外培養(yǎng)一直是一個重要環(huán)節(jié)。細胞要養(yǎng)好,就要用好血清,如Ausbian®特級胎牛血清,它適合各種細胞培養(yǎng),尤其適合難養(yǎng)細胞,如:干細胞、肝細胞,神經(jīng)細胞,原代培養(yǎng)、細胞融合、轉(zhuǎn)染細胞等。


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